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α-檀香烯是一种倍半萜烯，是α-檀香醇的前体，是东印度檀香油的主要成分之一。檀香油是世界上最珍贵的香水之一。除了用于香料和化妆品外，檀香油及其主要成分还具有镇静、抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤的作用。一般来说，檀香油是由檀香的心材和根部经蒸汽蒸馏得到的，会导致檀香树过度采伐，檀香油产量下降，价格上涨，且天然檀香烯的品质无法被化学合成的檀香香精化合物所替代。因此，需要在工程微生物细胞工厂中重建檀香烯途径，尽管已经构建了几种产α-檀香烯的微生物菌株，但低产率仍然阻碍了大规模发酵。来自南京林业大学的李迅等在《JournalofAgriculturalandFoodChemistry》上发表了《SesquiterpeneSynthaseEngineeringandTargetedEngineeringofα?SantaleneOverproductioninEscherichiacoli》的文章，该团队通过定点诱变檀香烯合酶，显著提高大肠杆菌中α-檀香烯的产量。首先作者以大肠杆菌为宿主，引入黄皮草来源的α-檀香烯合酶基因clss及整个MVA途径，获得菌株ECS中α-檀香烯的产量为6.4mg/L。考虑到是FPP的供应不足限制了α-檀香烯的生成，作者筛选了不同的FPP合酶来源，包括大肠杆菌来源的IspA及Erg20突变体F96W，以便有足够的FPP代谢流向α-檀香烯，其中含Erg20F96W的菌株ERS中α-檀香烯产量最高为.6mg/L。之后，作者探究了clss的分子修饰对α-檀香烯产量的影响，通过分析8个α-檀香烯合酶基因的序列及clss蛋白结构的同源模拟，选择了clss基因C端活性区的10个残基作为靶向突变的候选位点，从而获得包含9个突变体的clss修饰库，其中含有ClSSSA的菌株ERS中α-檀香烯的产量为.5mg/L，与ERS菌株相比增加了1.7倍。随后作者也对该残基继续进行饱和突变，获得的突变体中α-檀香烯的产量仍没有ERS菌株的效果好。接着，基于文献报道一半以上的异源蛋白聚集成不溶性包涵体是限制外源蛋白在大肠杆菌表达的重要限制因素，且研究表明适当的蛋白质或多肽与目的基因融合有利于蛋白质的稳定及重组蛋白的表达。因此为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达，作者首先选择了不同长度的蛋白质或多肽连接到clss的C端，在验证了融合标签连接到C端无效或起负面效果之后，作者进一步选择了4-螺旋束的蛋白质S-、DNA片段CmR29及其突变体CmR29M2连接到clss基因的N端。结果表明上述N端标签的融合均会使得α-檀香烯的产量增加，其中ERS菌株（含CmR29M2标签）中α-檀香烯显著增加至.8mg/L，并进行后续实验。之后，作者对ERS菌株的诱导条件进行了优化，在最佳诱导条件下（OD为2.4~2.5时加入0.5mMIPTG），该菌株α-檀香烯的产量为.2mg/L。最终最佳菌株ERS在1.3L生物反应器中进行分批补料发酵实验，α-檀香烯滴度达到mg/L，是目前大肠杆菌作为宿主生产α-檀香烯的最高水平。（彭倩倩摘译）licme


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