英文标题：SelectionandValidationofNovelRT-qPCRReferenceGenesunderHormonalStimuliandinDiferentTissuesofSantalumalbum

杂志：ScientificReports

影响因子：IF=4.

摘要

逆转录实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)因其高通量、特异性和敏感性而被广泛应用于基因表达水平的研究。为了获得准确可靠的结果，RT-qPCR分析必须有一个合适的参考基因。到目前为止，经济热带树种檀香((SantalumalbumL.)还没有被验证的可靠参考基因。在本研究中，有13个候选参考基因（包括从大量的檀香转录组数据中筛选出的12个新的可能的参考基因，以及目前使用的β-actin基因）在不同的组织(茎、叶、根和愈伤组织)、以及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA）、赤霉素(GA)处理作用下的愈伤组织中，用GeNorm，NormFinder，BestKeeper，DeltaCT和RefFinder算法综合验证。几种新的候选参考基因比目前使用的传统基因ACT要稳定得多。SA处理中ODD和Fbp1、MeJA处理中的CSA和Fbp3、JA处理中的PP2C和Fbp2、以及3个激素处理中FBP1和FBP2，分别是最准确的参考基因。当FAB1A与PP2C结合后，被鉴定为四种组织最适宜的参考基因组合。而HLMt,PPR和FAB1A的组合则是所有实验样本中最理想的参考基因。此外，为了验证我们的结果，我们还通过参考基因及他们的组合在MeJA处理下的三种檀香组织中评估了SaSSy基因的相对表达水平。本研究中所鉴定的参考基因将提高RT-qPCR分析的准确性，并将有助于不同组织和激素处理下的檀香功能基因组学研究。

材料和方法

植物材料：收集三株5-7年的檀香根、茎、叶。

用新芽诱导生成愈伤组织，并用SA、MeJA和GA处理。

利用RNA-seq数据筛选候选参考基因及引物设计

qPCR和扩增效率

基因稳定性分析：五个不同的程序：geNorm(版本3.5)，NormFinder，BestKeeper，DeltaCT和RefFind，被用来确定候选参考基因的稳定度。

参考基因的验证

为了验证RefFinder工具推荐的参考基因(包括最不稳定和最稳定的参考基因及其组合)的可靠性。合成α-，β-和epi-β-三烯的关键基因(檀香油(Z)-α-santalol和(Z)-β-santalol主要成分的前体）SaSSy的表达量被检测验证。分别在檀香的根、茎、叶及不同时间处理下MeJA处理的愈伤组织中用2-ΔΔCq方法检测。

结果

基于转录组数据的候选参考基因的选择

基于此前发布的RNAseq表达数据，筛选出变异系数（CV）在9.75%~11.95%之间的12个基因。表1列出了候选参考基因名称、GeneBank登录号、引物序列、TM值、扩增长度、扩增效率、R2值和KS-测试p值。

表1.选择候选参考基因、引物、TM和KS-测试p值和扩增特征

图1.13个候选参考基因的Cq值在所有实验样本中的分布。

候选参考基因在不同组织中的表达稳定性及在激素处理下檀香的表达稳定性

表2.geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT和RefFinder计算的13个候选参考基因的表达稳定性

图2.应用geNorm软件对13个参考基因的配对变异(V)分析。用geNorm法计算不同组织和激素处理样品中配对变化Vn/Vn+1

此外，我们还根据RefFinder推荐的综合排名,验证了候选参考基因在特定组织和不同组织组合中的稳定性(图3)。

图3RefFinder推荐的13个参考基因在特定组织和不同组织组合中的综合表达稳定性

不同组织和MEJA处理下所鉴定的参考基因的验证

为了验证所鉴定的参考基因，用参考基因中对一个关键基因Sassy的表达进行了研究，并在三种组织和MEJA处理下进行了鉴定。

图4.经验证的参考基因在檀香不同组织A）MEJA处理中B）的相对表达水平

总结

在本研究中，13个候选参考基因，包括从3个不同组织(茎、叶和根)的大量RNA-seq数据中筛选出的12个新基因，以及目前传统管家基因ACT，用RT-qPCR进行评定。

五种统计算法(geNorm,NormFinder,BestKeeper,DeltaCtandRefFinder)对这些参考基因的表达稳定性进行了评价。

还研究了合成檀香油主要成分的关键基因SaSSy，验证了新鉴定的稳定参考基因的适用性。

这一工作验证了一组更稳定的新的参考基因，并将促进、扩大和加强不同组织和激素处理下檀香中基因表达的分析。

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